Coloração de Gram

Por Marina Martinez
Coloração de Gram é uma técnica de coloração para diferenciação de microorganismos através das cores, para serem observados em microscópio óptico. A técnica recebeu este nome em homenagem ao médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram.

Por volta de 1884, Hans Gram observou que as bactérias, após serem tratadas com diferentes corantes, adquiriram cores diferenciadas.  Assim, as que ficavam roxas foram classificadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, foram chamadas de Gram-negativas. A técnica de Gram é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo muito utilizada atualmente, como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.

Procedimentos da coloração de Gram

  1. Em uma lâmina, contendo esfregaço seco, cubra-o pingando gotas de violeta-de-metila e deixe agir por 15 segundos;
  2. Adicione água ao esfregaço, em cima do violeta-de-metila, cobrindo toda a lâmina. Deixe agir por mais 45 segundos;
  3. Após o tempo corrido, escorra o corante e lave o esfregaço em um filete de água corrente.  Cubra a lâmina com lugol ou Iodo de Gram e deixe por 60 segundos;
  4. Escorra todo o lugol e lave em um filete de água corrente;
  5. Aplique álcool etílico a 95%, ou acetona, para descorar a lâmina por 10 a 20 segundos;
  6. Lave em um filete de água corrente;
  7. Cubra toda a lâmina com safarina e deixe corar por aproximadamente 30 segundos;
  8. Lave a lâmina em um filete de água;
  9. Seque a lâmina com auxílio de um papel de filtro limpo ou deixe-a secar ao ar livre;
  10. Aplique uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e observe no microscópico com objetiva de imersão (100 X).

Os resultados após a coloração de Gram permitem classificar as bactérias em dois grupos:

Quando as estruturas celulares são cobertas pelo corante violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adição do mordente (Soluto de Lugol), ocorre à formação do complexo iodo-pararosanilina, que tem como propriedade fixar o corante primário nas estruturas coradas.

Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando ocorre a lavagem, com ácool etílico, enquanto outras perdem sua coloração mais devagar ou a perdem completamente. O corante safranina colore novamente as estruturas que foram descoradas.

As bactérias Gram-positivas, que têm a parede celular composta por mureína (peptídeoglicano - peptídeo de ácido n-acetil murâmico), durante o processo de descoloração com álcool etílico, retém o corante, permanecendo com a coloração conferida pelo corante primário (roxo).  Já as bactérias Gram-negativas com parede celular composta predominantemente por ácidos graxos (lipopolissacarídeos e lipoproteínas), perdem o complexo iodo-pararosanilina, são incapazes de reter o violeta de Genciana, assumindo a cor do corante de fundo (vermelha).

São as diferenças da estrutura da parede bacteriana, principalmente com relação à espessura da camada de peptidoglicano, que é responsável pelo diferente comportamento das bactérias diante da coloração de Gram.

Leia também:

Referências Bibliográficas:
http://pt.wikipedia.org/wiki/Técnica_de_Gram
http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=306&ordem=1
http://www.prof2000.pt/users/biologia/tcolgram.htm