Imuno-histoquímica

Por Débora Carvalho Meldau
Imuno-histoquímica (IHQ) é o método de identificação de antígenos nos tecidos, utilizando o princípio da ligação específica de anticorpos e antígenos. Este termo derivou das palavras imuno e histologia. A primeira estuda o sistema imunológico, a segunda estuda tecidos e órgãos por meio da microscopia, sendo que, para facilitar a observação, diferentes tipos de colorações podem ser utilizadas para identificar diferentes partes de um tecido.

Este método de diagnóstico é rotineiramente usado para diagnosticar células anormais, como por exemplo, as encontradas em neoplasias. Específicos marcadores moleculares caracterizam acontecimentos celulares particulares, como, por exemplo, proliferação ou apoptose (morte celular). A IHQ também é muito utilizada na pesquisa básica que visa compreender a distribuição e localização de distintos biomarcadores e proteínas expressas em várias partes do organismo. A observação de uma interação antígeno-anticorpo pode ocorrer de diferentes maneiras. Mais comumente, um anticorpo conjuga-se com uma enzima, que por sua vez, irá catalisar uma reação que irá gerar coloração. De modo alternativo, o anticorpo pode ser marcado com um fluoróforo (fluoresceína, rodamina, Flúor DyLight ou Flúor Alexa).

Foi no fim dos anos 80, início da década de 90, que o uso desta técnica começou a ser amplamente aplicada na patologia clínica, pois o surgimento de novas técnicas criou uma detecção mais sensível. A técnica de hibridização tornou mais fácil o desenvolvimento da IHQ com a produção de anticorpos monoclonais altamente específicos, idênticos e em abundância.

Os anticorpos utilizados para a detecção específica podem ser de dois tipos: policlonais ou monoclonais. Estes últimos normalmente são considerados mais específicos. Os anticorpos policlonais resultam de injeções de um antígeno peptídico em animais e, por conseguinte, a um estímulo de resposta imune secundária, os anticorpos são isolados a partir do soro. Deste modo, os anticorpos policlonais são uma mistura heterogênea de anticorpos capazes de reconhecer epítopos distintos.

Os anticorpos também podem ser classificados como reagentes primários ou secundários. Os primários são sintetizados contra um antígeno determinado e são tipicamente não-conjugados (não-marcados). Já os anticorpos secundários são sintetizados contra anticorpos primários, responsáveis por reconhecerem imunoglobulinas de uma dada espécie e são conjugados à biotina ou a uma enzima fosfatase alcalina ou uma peroxidase.

A preparação das amostras varia de acordo com o tecido que será estudado, e também, do propósito do estudo. Podem ser feitos cortes delgados no material (4-40 µm), ou, caso o tecido não seja muito espesso, pode ser utilizado inteiro. Os cortes são feitos através de um micrótomo e, por conseguinte, colocados em lâminas.

Previamente, são preparadas lâminas de controle, com resultados já conhecidos, que podem ser fabricadas com tecidos do próprio paciente ou de outro indivíduo. Isto é feito para tentar reduzir faltas de padronização de processamento e fixação.

Para a detecção IHQ de antígenos nos tecidos, existem duas estratégias: método indireto e método direto. Em ambas as situações, a maioria dos antígenos também necessita de passos adicionais de desmascaramento, o que normalmente produz a diferença entre coloração e não coloração. Habitualmente, utilizam-se detergentes como o Triton X-100, capazes de diminuir a tensão superficial, possibilitando o uso de menos reagente para alcançar melhor e maior cobertura da amostra.

O método direto é considerado um método de coloração de um passo (one-step), e engloba um anticorpo marcado conjugado que se encontra reagindo diretamente com o antígeno que está na amostra de tecido. Este é um procedimento simples e rápido, pois utiliza apenas um anticorpo. Contudo, pode passar por determinados problemas, como sensibilidade, em conseqüência da diminuta amplificação de sinal, sendo utilizado em menor proporção quando comparado com o método indireto.

O método indireto abrange um anticorpo primário não-marcado que reage com o antígeno presente no tecido, e um anticorpo secundário marcado, capaz de reagir com o anticorpo primário. Esse método é mais sensível do que o anterior por apresentar a amplificação de sinal por meio de diferentes reações de anticorpos secundários com distintos sítios antigênicos de anticorpo primário. A camada de anticorpo secundário pode ser marcada com corante fluorescente ou uma enzima.

O método indireto, além de apresentar alta sensibilidade, apresenta a vantagem de que apenas uma pequena quantidade de anticorpos secundários conjugados necessita ser produzido.

A IHQ é indicada para as mais distintas pesquisas em um laboratório de patologia clínica, dentre elas:

  • Diferenciação entre proliferação celular benigna e maligna;
  • Identificação do tecido de origem de uma neoplasia morfologicamente indiferenciada;
  • Apontar o órgão de origem de uma neoplasia diferenciada;
  • Subtipagens de neoplasias (como no caso de linfoma);
  • Pesquisa de fatores prognóstico, terapêutico e índices proliferativos de determinada neoplasia;
  • Elucidação de estruturas, organismos e materiais secretados pelas células;
  • Detecção de células neoplásicas metastáticas.

Fontes:
http://pt.wikipedia.org/wiki/Imuno-histoquímica
http://www.medicina.ufba.br/imuno/roteiros_imuno/imunohistoquim.PDF

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